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《脈紅螺幼蟲變態過程多組學解析.caj 》




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更新時間:2020年2月08日

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脈紅螺幼蟲變態過程多組學解析及關鍵基因的調控作用_宋浩www.etubmp.live.caj
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www.etubmp.live電子書 脈紅螺(Rapana venosa),自然分布于我國的渤海、黃海和東海以及日本海等海域,是我國重要的經濟貝類,但在歐洲黑海、愛琴海、美國切薩皮克灣、阿根廷拉普拉塔河等海域為生物入侵種,對當地的雙殼貝類資源造成破壞。

脈紅螺幼蟲變態過程多組學解析及關鍵基因的調控作用作  者 : 宋浩學位授予單位 :  中國科學院大學(中國科學院海洋研究所)學位名稱 : 博士導師姓名 : 張濤學位年度 : 2018關鍵詞 : 脈紅螺;幼蟲;態過程;解析;基因摘  要 : 脈紅螺(Rapana venosa),自然分布于我國的渤海、黃海和東海以及日本海等海域,是我國重要的經濟貝類,但在歐洲黑海、愛琴海、美國切薩皮克灣、阿根廷拉普拉塔河等海域為生物入侵種,對當地的雙殼貝類資源造成破壞。變態過程是貝類生活史中重要的發育階段,變態的成功與否直接關系到貝類種群資源變動。因此,研究脈紅螺幼蟲變態機理,對于促進其苗種繁育、資源恢復、生物入侵防控等工作的開展具有重要的現實和理論意義。本研究利用RNA-seq、iTRAQ、GC-MS、Real time PCR等技術對脈紅螺幼蟲變態過程分子機理展開研究,從轉錄組水平、蛋白質組水平和代謝組水平揭示了幼蟲變態過程調控特征,篩選了脈紅螺變態過程中的差異表達的關鍵轉錄本/蛋白組/代謝物,并對它們在變態中發揮的潛在生物學功能進行了探討;開展了脈紅螺幼蟲變態過程microRNA的響應特征研究,篩選了變態中的差異表達的microRNA并對它們潛在調控的靶基因進行預測,揭示其在變態過程中所發揮的功能;篩選了在脈紅螺變態發育過程中和在不同組織中穩定表達的內參基因,為將來進一步研究關鍵基因在變態過程中的表達水平提供基礎;獲得關鍵基因5-HT receptor和NOS的c DNA序列,探討了其在脈紅螺變態過程中表達特點及調控機理。主要研究結果如下:1、早期發育階段的轉錄組建庫利用第二代高通量測序技術對其轉錄組進行測序,建立了脈紅螺轉錄組數據庫,為后繼的發育基因表達譜研究和分子調控機理研究提供了必要的條件。該轉錄組數據庫包涵212049條Unigene,平均大小為619bp。其中有70877條Unigene至少在一個數據庫內成功注釋,占所有序列的33.42%。對所有Unigene按功能進行了分類,討論了表達量最高的前20條基因潛在的生物學功能,并挑選了6條與神經內分泌相關的基因研究其在變態發育過程中的表達情況。2、變態過程的基因表達譜特征利用數字基因表達譜分析技術研究脈紅螺5個不同階段的基因表達的時空動態變化趨勢,并篩選發育階段特異性表達基因,構建發育調控相關的重要功能基因網絡,系統解析了調控脈紅螺變態過程的相關分子機理。通過對差異基因的聚類熱圖分析和GO富集分析發現,在變態過程中發生顯著改變的基因大部分與其生長、凋亡、神經內分泌系統、消化系統和免疫系統密切相關。對20條在變態前后顯著改變的差異表達基因進行qPCR實驗,發現數字基因表達譜的數據與qPCR的分析結果具有很好的一致性,說明RNA-seq的數據較為真實可靠。3、變態過程中蛋白組響應特征利用iTRAQ技術,開展脈紅螺變態前后差異蛋白組學研究,共鑒定到5312個蛋白。有1138個蛋白在幼蟲變態過程發生差異表達,其中470個蛋白在變態后發生了顯著上調,668個蛋白在變態后發生了顯著下調。變態前后的差異蛋白富集在77個生物功能、27細胞組分和63分子功能相關的GO條目下;有7條KEGG通路發生顯著富集。這些差異蛋白主要影響細胞骨架和細胞粘附、攝食和消化、應激反應和免疫、以及特異的組織發育等生理活動4、變態過程中代謝組響應特征利用GC-MS技術,開展脈紅螺變態前后差異代謝組學研究,共鑒定到263個代謝物。有53種代謝產物在幼蟲變態過程發生差異表達,其中29種代謝產物在變態后發生了顯著上調,24種代謝產物在變態后發生了顯著下調。在29種變態后上調的代謝物中,喹啉-4-羧酸指示了變態后免疫系統的進一步成熟,阿那啶可能參與幼蟲變態過程中NO和多巴胺的調控。在24種變態后下調的代謝產物中,麥芽三糖、葡萄糖-6-磷酸、纖維二糖和麥芽糖等儲能物質發生了顯著下調,反應了變態前后能量策略的不同。5、變態過程中microRNA響應特征利用Hi-seq技術,開展了脈紅螺變態過程中的差異microRNA組學研究,共鑒定到195條差異表達顯著的miRNA。對所有差異表達的miRNA進行了靶基因預測,并根據靶基因的注釋結果進行了GO和KEGG pathway富集分析,從而研究差異miRNA的潛在生物學作用。鑒定了變態過程中,調控“消化和吸收”、“細胞骨架和細胞粘附”和“細胞凋亡”等過程的miRNA,并進行了qPCR驗證。6、熒光實時定量PCR內參基因的篩選在脈紅螺發育基因表達譜中篩選了13個內參候選基因(EF-1α、ACT、COX1、NDUFA7、RLRL28、GAPDH、TUBB、RS25、RS8、UBE2和HH3)作為qPCR內參候選基因。利用BestKeeper、NormFinder和GeNorm等內參篩選程序,評估了其穩定性。在脈紅螺組織特異性分析中,EF-1α是最穩定的內參基因,而RL5和RL28可以作為第二備選內參基因。在脈紅螺幼蟲發育特異性分析中,RL28是最佳的內參基因候選,COX1和RL5可以作為第二備選的內參基因。7、變態過程中關鍵基因的克隆和表達首次克隆并獲得了脈紅螺變態信號轉導路徑中的關鍵基因(5-HT receptor和NOS)的cDNA全長,并進行了物種間序列比對和系統進化樹的構建。通過qPCR結果發現,5-HT receptor和NOS的表達量均在變態后發生了顯著下調。通過免疫組化染色揭示了5-HT receptor在脈紅螺幼蟲體內的早期發生規律,發現面盤器官上有以5-HT為信號傳導的三條主神經纖維和纖毛基部感受器所連接的復雜神經網絡結構,提示其可能與變態密切相關。  

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